Der erfolglose Tagträumer Larry Daley (Ben Stiller) glaubt, zu etwas Höherem berufen zu sein. Das stimmt, wie er bei seinem neuen Job als Nachtwächter in einem Naturkundemuseum bald erfährt. Nach Sonnenuntergang erwacht der komplette Bau zum Leben. Mayakrieger und Gladiatoren tragen ihre Schlachten mit Attila dem Hunnen (Patrick Gallagher) aus, ein Feuersturm rast durch das Neandertal und der T-Rex behauptet seine Spitzenposition in der Nahrungskette. Das Chaos drängt nach draußen und nur eine Wachsfigur von Präsident Roosevelt (Robin Williams) steht Larry mit Rat und Tat zur Seite.